სენგერის მეთოდით სექვენირება

სენგერის მეთოდით სექვენირება გამოიყენება დნმ-ის იმ კონკრეტული უბნისთვის, როდესაც, სრული ეგზომის სექვენირების შედეგად, ცნობილია გენომში მოსალოდნელი ცვლილებების ზუსტი კოორდინატები.

ნიმუშების უფასო ტრანსპორტირება

ბიომასალის მიწოდება საქართველოს მასშტაბით

30 სამუშაო დღემდე

შედეგის გაგზავნა ხდება ელექტრონული ფოსტის მეშვეობით 30 სამუშაო დღის განმავლობაში

სიზუსტე 99%

1 ციკლში შესაძლებელია 1000-მდე ნუკლეოტიდის წყვილის „წაკითხვა“ მაღალი სიზუსტით

მკაცრად კონფიდენციალური

ყველა მონაცემი და შედეგი არ შეიძლება გადაეცეს მესამე მხარეს

←

→

სექვენირების მიმოხილვა

დნმ-ის მოლეკულა არის გენეტიკური მონაცემების მატარებელი ყველა ცოცხალ ორგანიზმში. იგი შედგება უნიკალური თანმიმდევრობის მქონე ნუკლეოტიდების ორი კომპლემენტარული ჯაჭვისგან.

დამატებითი ნუკლეოტიდების წყვილი დნმ-ის მიმდევრობაში ასევე მოიხსენიება როგორც ბაზის წყვილი, შემოკლებით ბწ.

ადამიანის გენომი შედგება დაახლოებით 3 მილიარდი ნუკლეოტიდის წყვილისგან.

სექვენირება არის მეთოდი, რომელიც გამოიყენება ლაბორატორიულ პრაქტიკაში დნმ-ის თანმიმდევრობის დასადგენად.

გამოიყენება დიაგნოსტიკაში, გენში ან გენის რეგულატორულ ელემენტებში დარღვევის გამომწვევი ცვლილებების (პათოგენური მუტაციების) გამოსავლენად.

სენგერის მეთოდით სექვენირება

სიზუსტე 99% 1 ციკლში შესაძლებელია 1000-მდე ნუკლეოტიდის წყვილის „წაკითხვა“ მაღალი სიზუსტით

სენგერის მეთოდი მიეკუთვნება სექვენირების კლასიკურ მეთოდებს. იგი შემუშავებულ იქნა ფრედერიკ სენგერისა და მისი კოლეგების მიერ, 1977 წელს. მისი დახმარებით 1990-2003 წლებში, პროექტის “ადამიანის გენომი” ფარგლებში, პირველად მოხდა ადამიანის გენომის სრული გაშიფრვა.

დღეისათვის, სენგერის მეთოდით სექვენირება რჩება რელევანტურად და წარმოადგენს რუტინულ მეთოდს, როგორც გენეტიკურ დიაგნოსტიკაში, ასევე, სამეცნიერო -კვლევით პრაქტიკაში. ამ მეთოდის გამოყენებით, ერთ ციკლში 1000-მდე ნუკლეოტიდის წყვილისგან შემდგარი თანმიმდევრობის წაკითხვაა შესაძლებელია, 99%-მდე სიზუსტით.

დღეისათვის, სენგერის მეთოდით სექვენირება სრულად ავტომატიზებულია, რაც განაპირობებს მეთოდის სანდოობას და ხდის მას მარტივად შესასრულებელს. იგი წარმოადგენს სექვენირების “ოქროს სტანდარტს”. ავტომატიზაცია და სექვენირების გაზრდილი ეფექტიანობა უზრუნველყოფს მეთოდის შესაძლო დაბალ ღირებულებას.

ჩვენებები

NGS მეთოდით მიღებული მონაცემების დასადასტურებლად, პათოგენური ვარიანტების ან უცნობი კლინიკური მნიშვნელობის მქონე ვარიანტების იდენტიფიცირებისას.
პაციენტის გენეტიკური სტატუსის დასადგენად, როდესაც დადგენილია მუტაციის შემთხვევა ერთ-ერთ ნათესავში და ცნობილია მისი ზუსტი მდებარეობა გენომში.

NGS მეთოდით მიღებული მონაცემების უზარმაზარი მოცულობის გამო, ზოგიერთი უბანი შეიძლება არაზუსტად იქნას წაკითხული, ამიტომ რეკომენდებულია დადასტურება მოხდეს სენგერის მეთოდით სექვენირებით.

მახასიათებლები

სენგერის მეთოდით სექვენირების ფუნდამენტური პრინციპი არის დიდეოქსინუკლეოტიდების გამოყენება და ასევე, ცნობილია, როგორც “ჯაჭვის ტერმინაციის მეთოდი”.

1. დნმ-ის სინთეზის რეაქცია ტარდება ნიმუშში არსებული მატრიცის (კონკრეტული ინდივიდის ერთჯაჭვიანი გენეტიკური თანმიმდევრობა) საფუძველზე, უნდა მოხდეს ამ მატრიცის სექვენირება.

2. დნმ-ის მოლეკულა სინთეზდება დნმ-პოლიმერაზას მეშვეობით, რომელიც, მატრიცის შესაბამისად, ნუკლეოტიდებს განალაგებს მზარდ ჯაჭვში ერთმანეთის მიმდევრობით.

ნუკლეოტიდების საერთო რაოდენობას შორის 1% არის “ტერმინირებადი”, რომლებიც, ამავდროულად, ატარებენ სპეციალურ ფლუორესცენტურ მარკერს.

ასეთი ნუკლეოტიდების ჩართვის შემდეგ, ჯაჭვის შემდგომი სინთეზი შეუძლებელი ხდება. რამდენადაც, “ტერმინირებადი”, მარკერიანი ნუკლეოტიდების ჩართვა წარმოადგენს რანდომულ მოვლენას, კომპლემენტარული მოლეკულის სინთეზი შეიძლება შეწყდეს, როგორც საწყის, ასევე, საბოლოო ეტაპზე.

შედეგად, ფორმირდება უნიკალური დნმ-ის სხვადასხვა სიგრძის ფრაგმენტების ერთობლიობა, რომელიც იწყება იმავე გზით, მაგრამ სრულდება დნმ-ის ჯაჭვის მატრიცის გასწვრივ სხვადასხვა პოზიციებზე და მთავრდება ოთხი ნუკლეოტიდიდან ერთ-ერთით.

3. შემდეგ, ამ ფრაგმენტების ზომის მიხედვით სეპარაციისათვის გამოიყენება კაპილარული ელექტროფორეზი.

სინთეზირებული დნმ-ის ფრაგმენტები გამოყოფილია ელექტრული ველის მოქმედებით: რაც უფრო პატარაა ფრაგმენტი, მით უფრო სწრაფად მოძრაობს იგი გელში.

ამგვარად, ფრაგმენტები განლაგდებიან კაპილარში, სიგრძეზე.

ამის შემდეგ, ხდება ფლუორესცენტური ნუკლეოტიდის დეტექცია ყოველი ფრაგმენტის დაბოლოებაზე და განისაზღვრება საკვლევი ნიმუშის დნმ-ის სრული ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობა.

NGS-ისა და სენგერის შედარება

სენგერის მეთოდით სექვენირების შექმნიდან, გრძელდება დნმ-ის გაშიფვრის ალტერნატიული გზების ძიება და შემუშავება. დღეისათვის, NGS მეთოდი საკმაოდ გავრცელებულია. თუმცა, ყველა ტექნელოგიას გააჩნია თავისი მახასიათებლები და მეთოდის შერჩევა ხდება დასახული მიზნის შესაბამისად.

სენგერის მეთოდს აქვს რიგი შეზღვუდვები

მას შეუძლია ერთდროულად წაიკითხოს ერთი ადამიანის დნმ-ის 1000-მდე ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობა.

გარდა ამისა, შეუძლებელია უჯრედების გარკვეულ პოპულაციაში ცვლილებების გამოვლენა, როდესაც ნიმუშის უმეტესობაში გენის ნორმალური ასლი არსებობს. მაგალითად, ცვლილებები ხდება სიმსივნურ უჯრედებში, რაც იწვევს მათ უკონტროლო ზრდას. მსგავსი ცვლილებები არ იქნება ორგანიზმის არცერთ სხვა უჯრედში.

სენგერის მეთოდით სექვენირება იძლევა ცვლილებების გამოვლენის საშუალებას მხოლოდ იმ შემთხვევაში, თუ ისინი ვლინდება შესასწავლი დნმ-ის მინიმუმ 15-20%-ში.

15-20% ” შესასწავლი მასალის 15-20% უნდა შეიცავდეს ცვლილებებს, რათა მოხდეს მათი იდენტიფიცირება სანგერის მეთოდით”

შემდეგი თაობის სექვენირების მეთოდი NGS

ამავდროულად, ცალკეული უბნების ინტერპრეტაციის სიზუსტე დამოკიდებულია მათი “წაკითხვების” რაოდენობაზე.

NGS მეთოდი საშუალებას იძლევა, მივიღოთ მონაცემები დნმ-ის გაცილებით დიდი მონაკვეთების შესახებ (სრული გენომის სექვენირებამდე) და იდენტიფიცირდეს გამოკვლეული დნმ-ის დაახლოებით 5%-ში შემავალი ვარიანტები (მუტაციები). თუმცა, ეს ხდება დნმ-ის მოკლე (საშუალოდ, კლინიკურ ლაბორატორიებში ყველაზე ხშირად გამოყენებული მეთოდებისთვის, 100-300 ნუკლეოტიდის თანმიმდევრობა) თანმიმდევრობების დიდი რაოდენობის ერთდროულად წაკითხვისას, რაც შემდეგ იკრიბება და ანალიზდება.

ასეთი ინფორმაციის დამუშავება შრომატევადი პროცესია და მოითხოვს სპეციალისტის მაღალ კვალიფიკაციას.

იმ შემთხვევაში, თუ საეჭვოა, რომ იდენტიფიცირებული ვარიანტი წარმოადგენს დაავადების გამომწვევ მიზეზს, “წაკითხვის” სიზუსტის ხარისხი უნდა იყოს 100%. ამის შემდეგ, პათოგენური ან სავარაუდო პათოგენური ვარიანტის არსებობის კონფირმაცია უნდა მოხდეს სენგერის მეთოდით სექვენირებით.

ამასთან, NGS მეთოდი ნაკლებად ხარჯთეფექტურია, შესაბამისად, არამომგებიანია მისი გამოყენება მხოლოდ მცირე მონაცემების ანალიზისთვის.

ამრიგად, როდესაც ცნობილია გენომის სავარაუდო ცვლილების ზუსტი კოორდინატები (მაგალითად, თუ პათოგენური ან სავარაუდო პათოგენური ვარიანტი იქნა ნაპოვნი ერთ-ერთ ახლო ნათესავში), არ არის საჭირო კიდევ ერთხელ ჩატარდეს სრული ეგზომის სექვენირება. შესაძლებელია, მოხდეს დნმ-ის სამიზნე უბნის სექვენირება სენგერის მეთოდით.

5% NGS მეთოდით გამოსაყენებლად, საკვლევი მასალის 5% უნდა შეიცავდეს ცვლილებებს.